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问题:

[问答题] 如何以大肠杆菌质粒 DNA为载体克隆一个编码动物激素的基因,并使之在大肠杆菌中进行表达?简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。

冯亮和丁明是初二的学生,最近两个都有些心事。于是,凑在一起聊天…… 冯:你说咱们已经快要和爸爸一样高了,可父母还老把我们当小孩看,什么都管。 丁:可不是吗?吃饭要管,穿衣服要管,去哪玩也要管,放学回家稍晚就唠叨个不停……真烦!有时他们让我做什么,我偏不听他们的话。 丁:最近一段时间,我情绪似乎失控了。今天的课堂演讲,我紧张得要命,生怕在老师同学面前出丑。 冯:我发现了,你脸都红到脖子根了。 丁:不光这个,有时高兴起来,我就跟飞上天似的,觉得无所不能,可是难过起来,又像被打入了18层地狱…… 冯:我也一样,就比如每次女同学打招呼,我都莫名地心中加速,想说既紧张又害羞,以前不是这样。 丁:有时候也会担心自己在别人眼中形象不好,譬如不够帅之类的。 冯:还有不够优秀,能力不够强等。特别希望在别人眼中我是一个聪明有实力的人。 丁:我特别理解你,这种感觉我也有,而且特想跟人倾诉,但就是不知道该跟谁说。 作为老师,你会对他们提出哪些建议? 冯亮和丁明是初二的学生,最近两个都有些心事。于是,凑在一起聊天…… 冯:你说咱们已经快要和爸爸一样高了,可父母还老把我们当小孩看,什么都管。 丁:可不是吗?吃饭要管,穿衣服要管,去哪玩也要管,放学回家稍晚就唠叨个不停……真烦!有时他们让我做什么,我偏不听他们的话。 丁:最近一段时间,我情绪似乎失控了。今天的课堂演讲,我紧张得要命,生怕在老师同学面前出丑。 冯:我发现了,你脸都红到脖子根了。 丁:不光这个,有时高兴起来,我就跟飞上天似的,觉得无所不能,可是难过起来,又像被打入了18层地狱…… 冯:我也一样,就比如每次女同学打招呼,我都莫名地心中加速,想说既紧张又害羞,以前不是这样。 丁:有时候也会担心自己在别人眼中形象不好,譬如不够帅之类的。 冯:还有不够优秀,能力不够强等。特别希望在别人眼中我是一个聪明有实力的人。 丁:我特别理解你,这种感觉我也有,而且特想跟人倾诉,但就是不知道该跟谁说。 上面两位同学的对话,反映了中学生青春期心理发展的哪些特点? 学生张琼进入青春期后,非常关注自己的相貌。但她认为自己长相难看,不被人喜爱。看到同学聚在一块咯咯地笑,她就认为她们在笑话自己;在寝室里,若听到同学在谈论某某长得漂亮,会以为是在影射自己;上课未被老师点名发言,也会认为老师嫌自己难看不愿意点自己……所有这一切致使她郁郁寡欢,不愿意与同学沟通交流,学习效率低下,学习成绩明显下降。请运用心理学知识分析案例中张琼的问题,并提出合理建议。 班级常规管理建立的检查监督系统,包括以下检查监督方式() ["自检","互检","班干部检查","班集体检查","班主任摘检"] 在建设工程竣工验收后,向建设行政主管部门或者其他有关部门移交建设项目档案的主体是()。 ["施工单位","建设单位","设计单位","监理单位"] 如何以大肠杆菌质粒 DNA为载体克隆一个编码动物激素的基因,并使之在大肠杆菌中进行表达?简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。
参考答案:

要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达,通常遇到的问题有:
(1)细菌的 RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子。
(2)大多数真核基因有内含子,这些内含子在转录后从前体 mRNA 中被切除而形成熟 mRNA。细菌细胞没有这样的机制来去除内含子。
(3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分子加工而来的,例如胰岛素就是通过加工去除前体分子内部的 33个氨基酸残基而来,剩下的两段肽链分别形成胰岛素的α、β链。
(4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解。针对上述可能出现的问题,建议在克隆的过程中采取以下措施:
①应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子 ATG的细菌强启动子的附近(含有这种序列的载体称表达载体)。
②可以以激素的 mRNA为模板用反转录酶合成激素的基因。
这种 DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆。此外,如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因。合成的基因应含起始密码 ATG、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列,以及 1~2 个终止密码:
A.TG———————编码序列——————TGA  TAG
现在,这个合成基因可被插入载体中。
③有时加工过程可以在离体条件下进行。如果加工有困难,可以用合成基因,从而免除加工过程。
④选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解。如果用酵母作为宿主上述许多问题都可以较容易地解决,尤其是现在有既能在大肠杆菌中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体。
说明:
1)ATG,TAG和TGA是对应mRNA中的转录起始信号AUG和终止信号UAG,UGA 的DNA序列。
2)克隆生长素释放抑制因子基因时采用化学合成基因的方法。生长素释放抑制因子是一种由下丘脑分泌的激素,长14个氨基酸残基,因此人工合成的基因,包括在宿主菌中表达所需的转录的起始和终止信号,仅51bp长。

  参考解析

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